рефераты бесплатно
Рефераты бесплатно, курсовые, дипломы, научные работы, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, сочинения,рефераты литература, рефераты биология, рефераты медицина, рефераты право, большая бибилиотека рефератов, реферат бесплатно, рефераты авиация, рефераты психология, рефераты математика, рефераты кулинария, рефераты логистика, рефераты анатомия, рефераты маркетинг, рефераты релиния, рефераты социология, рефераты менеджемент и многое другое.
ENG
РУС
 
рефераты бесплатно
ВХОДрефераты бесплатно             Регистрация

Белок - основа жизни  

Белок - основа жизни

Приложение № …

Описание некоторых лабораторно-практических работ, используемых при

апробации спецкурса „Белок – основа жизни“.

I. Выделение белков из тканей и биологических жидкостей.

Цель: выявить содержание белков в тканях и биологических жидкостях.

1. Выделение казеина из молока.

Вариант I.

В химический стакан вместимостью 50 мл отмеривают цилиндром 3 мл

молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и

добавляют 10-15 капель 1%-ного раствора соляной кислоты. Кислоту приливают

аккуратно, по каплям, так как в избытке кислоты осадок растворяется.

Суспензию перемешивают, через 3-5 минут образуется рыхлый осадок.

Для удаления соляной кислоты в стакан добавляют 10 мл дистиллированной

воды, перемешивают и оставляют ещё на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с

осадка. К осадку ещё раз добавляют 10 мл дистиллированной воды, осторожно

перемешивают содержимое стакана и через 5 минут фильтруют смесь через

бумажный фильтр.

Доказательством того, что в состав казеина входит фосфор: осадок с

фильтром переносят в широкую пробирку с обратным холодильником и добавляют

6 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Пробирку нагревают на песчаной

бане в течение 1 часа. Жидкости дают остыть и нейтрализуют её

концентрированной азотной кислотой до слабокислой реакции на лакмус. При

нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного

гидролиза белка.

После отстаивания жидкость фильтруют и с фильтратом проделывают

биуретовую реакцию и молибденовую пробу на фосфорную кислоту. К 5 каплям

гидролизата добавляют 10%-ый раствор NaOH и 2 капли 1%-ого раствора CuSO4.

Наблюдается фиолетовое окрашивание. К 10 каплям молибденового реактива

добавляют 5 капель гидролизата и кипятят несколько минут. В присутствии

H3PO4 жидкость окрашивается в лимонно-жёлтый цвет. При охлаждении выпадает

жёлтый кристаллический осадок комплексного соединения (NH4)3PO4(12MoO3.

Вариант II.

К 50-ти мл свежего молока добавляют равный объём насыщенного раствора

сульфата аммония. При этом выпадают в осадок альбумины и казеин.

Отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр раствор альбуминов.

2. Получение раствора яичного альбумина.

Осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и

выливают белок в стакан вместимостью 500 мл. В тот же стакан добавляют 250

мл дистиллированной воды и содержимое стакана тщательно перемешивают

стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

Затем раствор переносят в мерный цилиндр, и объём раствора доводят до

300 мл добавлением дистиллированной воды. Раствор оставляют на 30 минут при

комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов,

затем разливают в пробирки по 20 мл.

20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.

Фильтрат, содержащий яичный альбумин, используют для дальнейшей работы.

3. Выделение белков мяса.

Помещают в стакан 40-50 г пропущенного через мясорубку обезжиренного

мяса, добавляют 80-100 мл 10%-го раствора NaCl и оставляют смесь стоять 15-

20 минут при частом помешивании. Отфильтровывают через бумажный складчатый

фильтр или через двойной слой марли окрашенную в красный цвет жидкость. В

растворе содержатся главным образом, мышечный альбумин и глобулин.

4. Выделение растительных альбуминов.

25 грамм пшеничной муки смешивают со 100 мл дистиллированной воды, и

смесь стряхивают в течение одного часа с помощью встряхивателя. Взвесь муки

центрифугируют и надосадочную жидкость фильтруют через складчатый фильтр.

Отфильтрованный прозрачный раствор содержит преимущественно альбумин

пшеничных зёрен.

II. Реакции осаждения белков.

Цель: выявить влияние различных органических и неорганических веществ

на осаждение белков. Изучить физические свойства белков.

1. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

В три сухие пробирки наливают по 1-2 мл концентрированной HNO3, H2SO4,

HCl. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке добавляют из

пипетки по 0,5 мл исследуемого раствора белка, так чтобы он не смешивался с

кислотой. Вместе соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный

осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший при действии HNO3,

увеличивается, а осадки выпавшие при действии HCl и H2SO4, растворяются в

их избытке.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимые осаждения

белков. Это связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с

денатурацией белка.

2. Осаждение белков органическими кислотами.

В две пробирки добавляют по 2-3 мл раствора белка и добавляют в одну

из них несколько капель 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а в

другую – несколько капель 20%-го раствора сульфосалициловой кислоты. В

обоих случаях наблюдается выпадение осадка белка. Сульфосалициловая и ТХУ

кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок.

ТХУ кислота осаждает только белки и не осаждает продукты распада белка

и аминокислоты, поэтому ею пользуются часто для полного удаления белков из

биологических жидкостей (например, сыворотки крови).

3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

В две пробирки добавляют по 1-1,5 мл исследуемого пастора белка, по

каплям при встряхивании, добавляют в одну из них раствор CuSO4, а другую –

Pb(CH3COO)2. Выпадает хлопьевидный осадок вследствие образования

малорастворимого солеобразного соединения (с солью меди – голубого цвета).

При избытке реактива осадок снова растворяется.

Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое

осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Потому

что белки применяют в качестве противоядия при отравлении, например,

ртутными солями (сулема).

III. Гидролиз белка.

Цель: дать учащимся представление о кислотном, щелочном и

ферментативном гидролизе белка. Опытным путём установить продукты распада

белковой молекулы.

1. Кислотный гидролиз простого белка.

При гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные продукты

– пептоны, затем на полипептиды и, наконец, на аминокислоты.

Для гидролиза отмеривают в круглодонную колбу 20 мл раствора яичного

белка и 5 мл концентрированной HCl. Колбу закрывают пробкой с длинной

стеклянной трубкой. Кипятят содержимое колбы под тягой в течение 45 или 90

минут.

Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при

помощи биуретовой реакции. Промежуточные продукты распада белка – пептоны –

при проведении биуретовой реакции дают розовое или красное окрашивание, а

белки – сине-фиолетовое.

2. Ферментативный гидролиз белка.

Подготовительный этап: белок куринового яйца развести 1:1 водой и

раствор белка влить в кипящую воду (V=100 мл) при помешивании.

В две пробирки налить по 2 мл приготовленного раствора белка. В первую

добавить 1 мл дистиллированной воды, во вторую – 1 мл 1%-го раствора

пепсина. Обе пробирки поставить в водяную баню при t=37-40 0C на 15 минут.

Проделать биуретовую реакцию с содержимым обеих пробирок.

В воде окраска более интенсивная (фиолетовая с синим оттенком), так

как при гидролизе осталось больше пептидных связей, чем в случае с пепсином

(окраска менее интенсивная – фиолетовая с розовым оттенком) – меньше

пептидных связей.

В присутствии пепсина гидролиз идёт интенсивнее, чем в присутствии

воды.

IV. Денатурация белков.

Цель: определить факторы, вызывающие денатурацию белка.

4.1. В три пробирки наливают по два мл раствора белка куриного яйца,

предварительно разведённого 1:20 и профильтрованного через двойной слой

марли.

В первую пробирку наливают насыщенный раствор сульфата аммония; во

вторую – концентрированную HNO3; в третью – этиловый спирт. Белок

свёртывается во всех пробирках.

4.2. В три пробирки добавляют по 2 мл раствора белка. Во вторую

добавляют одну каплю 1%-го раствора уксусной кислоты; в третью – одну каплю

10%-го раствора NaOH. Все три пробирки нагревают над пламенем спиртовки.

В первой пробирке (pH=7) образуется осадок белка, вследствие его

денатурации при нагревании, во второй пробирке осадок образуется быстрее и

полнее вследствие нейтрализации белка в слабокислой среде; в третьей

пробирке (pH>7) осадка не образуется даже при кипячении.

V. Качественные реакции на белки.

(Цветные реакции на белки; определение аминокислотного состава

белков).

Цель: Путем качественных реакций определить наличие пептидных связей и

NH2 – групп в молекулах белков; выявить аминокислотный состав белков.

1. Обнаружение в молекулах белков пептидных связей (биуретовая

реакция).

К 1-2 мл разбавленного белка добавляют двойной объем 30%-ного раствора

NaOH хорошо перемешивают и приливают 2-3 капли 1%-ного раствора CuSO4.

Снова тщательно перемешивают. Развивается красно-фиолетовое окрашивание.

(Химизм реакции см. на стр.…).

2. Нингидриновая реакция.

К 2-3 мл разбавленного раствора белка приливают 3-4 капли 1%-ного

раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и

ставят в водяную баню при t=70 0С на несколько минут. Развивается сине-

фиолетовое или розово-фиолетовое окрашивание.

Нингидриновая реакция доказывает наличие NH2 – групп в белках (химизм

реакции на стр.…).

3. Ксантопротеиновая реакция (реакция на ароматические

аминокислоты: фенилаланин, тирозин, триктофан).

В одну пробирку добавляют 5 капель раствора яичного белка, во вторую –

раствора желатина, в третью – раствора миозина. Во все пробирки приливают

по 3-5 капель концентрированной HNO3 и нагревают. В первой и третьей

пробирках образовался белый осадок, который при нагревании окрашивается в

желтый цвет и постепенно растворяется в (происходит гидролиз белка),

сообщая желтую окраску раствору. Желатина, не содержащая ароматических

аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы. Образование желтых пятен на

коже при попадании концентрированной HNO3 обусловлено этой реакцией (химизм

реакции на стр.…).

4. Реакция на тирозин (реакция Миллона).

Реакция обусловлена наличием в белках аминокислоты тирозина. При

нагревании или продолжительном стоянии раствора белка с реактивом Миллона

(раствор нитратов ртути (I) и (II) в HNO3 с примесью HNO2) образуется

осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в кроваво-красный цвет.

В 4 пробирки наливают по 5 капель: в первую – раствора яичного белка,

во вторую – раствора желатина; в третью – раствора миозина; в четвертую –

раствора тирозина. Во все 4 пробирки добавляют по 2-3 капли реактива

Миллона и осторожно нагревают. Наблюдают происходящие изменения (химизм

реакции на стр.…).

5. Реакция на цистеин (реакция Фоме).

В первую пробирку приливают 5 капель 1%-ного раствора яичного белка,

во вторую – 1%-ного раствора желатины, в третью – раствора миозина. В

каждую пробирку добавляют по 5 капель 30%-ного раствора NaOH и по 1 капли

5%-ного раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость в

пробирках с яичным белком и миозином темнеет, так как образуется черный

осадок сульфида свинца. В пробирке с раствором желатина черного осадка не

образуется, так как данное вещество не содержит серосодержащих аминокислот

(химизм реакции на стр.…).

6. Реакция на аргинин (реакция Сакагути).

В первую пробирку приливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую

– раствора желатина, в третью раствора миозина. Во все пробирки добавляют

несколько кристаллов резорцина, 1 мл 3%-ного раствора H2O2 и осторожно по

стенке приливают 1 мл концентрированной серной кислоты. Через некоторое

время на границе раздела (белок – кислота) развивается оранжевое

окрашивание (химизм реакции см. на стр.…).

7. Реакция на триптофан (реакция Шульце-Распайля).

В пробирку с раствором белка приливают 2 капли раствора сахарозы и 1

мл концентрированной серной кислоты, следя, чтобы жидкости не смешивались.

Страницы: 1, 2


© 2010.