рефераты бесплатно
Рефераты бесплатно, курсовые, дипломы, научные работы, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, сочинения,рефераты литература, рефераты биология, рефераты медицина, рефераты право, большая бибилиотека рефератов, реферат бесплатно, рефераты авиация, рефераты психология, рефераты математика, рефераты кулинария, рефераты логистика, рефераты анатомия, рефераты маркетинг, рефераты релиния, рефераты социология, рефераты менеджемент и многое другое.
ENG
РУС
 
рефераты бесплатно
ВХОДрефераты бесплатно             Регистрация

Реферат: Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини  

Реферат: Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

ГІЛЬЧУК Юлія Миколаївна

УДК 577.21 : 577.213.3 : 577.215

577.217 : 577.218

ЕФЕКТИ, ОБУМОВЛЕНІ ВВЕДЕННЯМ У КЛІТИНИ ССАВЦІВ ТРАНСГЕНА АПОЛІПОПРОТЕЇНУ А-1 ЛЮДИНИ


03.00.22 - молекулярна генетика

Автореферат

дисертац на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ − 2008


Дисертацією рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України, академік АМН України

Кордюм Віталій Арнольдович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу регуляторних механізмів клітини.

Офіційн опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Строковська Людмила Іванівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімічної генетики;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Літошенко Олександр Якович,

Інститут геронтології АМН України, керівник лабораторії молекулярної та клітинно біології.

Захист дисертац відбудеться «24» червня 2008 р. о 10 годині на засіданн спеціалізованої вченої ради Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано « 24 » травня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізовано вченої ради,

кандидат біологічних наук                                        О.В. Підпала


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останн роки інтенсивно розвиваються дослідження, які спрямовані на корекцію певних генетичних дефектів введенням цільових генів у клітини реципієнта – генна терапія (ГТ) (Verma et al., 2005). ГТ, як напрямок, сформувалася на перетині молекулярної генетики та медицини і спочатку була зосереджена на лікуванні спадкових моногенних  захворювань, таких, як дефіцит аденозиндезамінази, муковісцидоз, гемофілія, дефіцит α-1 антитрипсину та інших (Patil et al., 2005). На сьогодн генно-терапевтичні дослідження поширились на полігенні та інфекційн захворювання; більше 60 % клінічних випробувань ГТ стосуються терапії злоякісних пухлин, велика кількість зусиль спрямована на лікування синдрому набутого мунодефіциту (Edelstein et al., 2007). Для медичного використання схвалено перший препарат «Gendicine» (SiBiono Genetech, Китай) (Pang et al., 2005) для лікування різних форм раку.

Прикладом полігенного захворювання, для якого інтенсивно розробляють схеми генно-терапевтично корекції на стадії доклінічних досліджень, є атеросклероз. Атеросклероз − одне із найпоширеніших захворювань у світі, проявами якого є звуження просвіту судин внаслідок порушення метаболізму ліпідів та, як наслідок, обмеження кровообігу до життєво важливих органів (Оганов и соавт., 2002). Першим кандидатом для ГТ атеросклерозу людини є ген основного білка ліпопротеїдів високої густини (ЛПВГ) − аполіпопротеїну А-1 (АРОА1) (Eckardstein et al., 2001).

 Основними проблемами як для підходів генно-терапевтичної корекції атеросклерозу, так загалом для ГТ, є необхідність підвищення ефективності та тривалост функціонування в організмі рекомбінантних векторів, які містять терапевтичний ген, зниження їхньої токсичності, імуногенності та інших можливих негативних ефектів.

Для доставки гена АРОА1 людини in vivo вже використовували рекомбінантні вірусні вектори, комплекси плазмід із такими носіями, як модифікований полі-L-лізин, ліпосоми та інше. У роботах (Oka et al., 2007; Lebherz et al., 2007) авторами з використанням рекомбінантних аденовірусних векторів (рАд) та векторів на основі адено-асоційованого вірусу (рААВ) показано можливість забезпечення високого рівня синтезу АРОА1 людини у піддослідних мишей, який утримувався після одноразового введення вектора майже два роки. У той же час, застосування вищезазначеної системи рАд векторів для ГТ атеросклерозу на кролях продемонструвало низьку ефективність (Snoeys et al., 2007; Lievens et al., 2004). Використання рекомбінантних вірусних векторів для повторюваних введень цільового гена часто неефективне через продукування нейтралізуючих антитіл (Monhan et al., 2000; Amalfitano et al., 2002). Крім того, безпечність використання вірусних векторів є нагальною проблемою ГТ та робить актуальним розробку саме невірусних засобів доставки цільових генів.

З іншого боку, спроби доставки цільової ДНК з геном АРОА1 людини в організм мишей з використанням таких носіїв, як галактолізований полі-L-лізин (Диже и соавт., 2001; Перевозчиков и соавт., 1997), забезпечили низький рівень експресії трансгена, хоча було показано ефективність повторних ін’єкцій препаратів. Введенням гідродинамічною ін’єкцією плазмідної ДНК вдалось досягнути у десятки разів вищого рівня експресії АРОА1 людини у піддослідних тварин (Акифьев и соавт., 2004) порівняно з зазначеними раніше носіями. Однак, зазначений метод переносу ДНК є небажаним для ГТ атеросклерозу людини, особливо, для пацієнтів із серцево-судинними захворюваннями.

Одним із найефективніших носіїв для доставки плазмідних векторів in vivo поліетиленімін (ПЕІ) (Boussif et al., 1995). Однак, при введенн комплексів ДНК/ПЕІ внутрішньовенною ін`єкцією експресію трансгена виявляють переважно у тканинах легенів (Goula et al., 1998). З іншого боку, описано чимало випадків ефективного переносу плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ при локальному введенні препарату (Goula et al., 1998). Рівень експресії введених у клітини ссавців генів залежить від багатьох чинників, у тому числі і від сили елементів регуляції транскрипції трансгена. У випадку необхідності забезпечення високого рівня експресії трансгена перспективним вважається його розміщення у векторі під контролем сильних промоторів.

Таким чином, актуальним є вивчення експресії гена АРОА1 людини in vitro та in vivo при введенні рекомбінантної плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ, а також встановлення впливу на рівень експресії гена АРОА1 людини сильних гібридних промоторів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках плану фундаментальних досліджень відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.3. Вивчення на модельних об’єктах очікуваних терапевтичних ефектів, обумовлених введенням рекомбінантних молекул” (№ державної реєстрації 0103V000075, 2003-2007 pp.).

Мета та завдання дослідження: Метою даної роботи є дослідження експресії клітинами СНО-К1 гена АРОА1 людини, який знаходиться у складі рекомбінантних плазмід під регуляцією різних сильних промоторів, вивчення експресії, тривалості знаходження та локалізації трансгена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин.

Для досягнення цієї мети поставлено такі завдання:

1.   Створити рекомбінантн плазміди, які містять ген АРОА1 людини під контролем енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини з інтроном А цього ж гена (hCMV-ІA) та енхансеру середньораннього гена цитомегаловірусу людини, промотору та першого інтрону гена β-актину курчати (CAG), для  експресії в клітинах ссавців in vitro та in vivo.

2.   Одержати трансфікован клітини культури клітин яєчників китайського хом’яка (СНО-К1) при використанн невірусного методу доставки цільової плазмідної ДНК.

3.   Дослідити експресію гена АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1, одержаними для різних рекомбінантних плазмід.

4.   Розробити експериментальну модель для дослідження експресії трансгена АРОА1 людини in vivo.

5.   Дослідити експресію гена АРОА1 людини, локалізацію та тривалість його знаходження в організмі піддослідних тварин при використанні невірусного методу доставки цільової ДНК.

Об’єктом дослідження експресія трансгена АРОА1 людини in vitro та in vivo, локалізація та тривалість знаходження трансгена в організмі піддослідних тварин.

Предметом дослідження є ген АРОА1 людини, що знаходиться в рекомбінантних плазмідах під контролем різних елементів регуляції транскрипції.

Методи дослідження мікробіологічні (нарощування і культивування бактерій, трансформація бактерій), генно-інженерні (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), зворотна транскрипція, виділення і рестрикційний аналіз плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних ДНК, гель-електрофорез ДНК), молекулярно-біологічні (експресія білків), імунохімічні (ферментний імуносорбентний аналіз (ELISA), Вестерн-блот аналіз), біохімічні (електрофорез білків), мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини (hCMV-ІЕ), hCMV-ІA та CAG. Вперше показано можливість доставки рекомбінантних плазмід із геном АРОА1 людини у клітини ссавців ін’єкцією комплексів плазмідна ДНК/ПЕІ у паренхіму печінки. Вперше досліджено характер локалізації та тривалість знаходження гена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин при введенні плазмідної ДНК у склад комплексів з ПЕІ.

Практичне значення одержаних результатів. Одержано стабільно трансфіковані клони культури клітин СНО-К1, що продукують білок АРОА1 людини. Оптимізовано методи імунохімічної детекц АРОА1 людини у плазмі крові трансфікованих тварин.  Результати дослідження можуть бути використані при розробці підходів до генно-терапевтичної корекц атеросклерозу, заснованої на використанні невірусної системи доставки цільово ДНК.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, отримано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема, автором самостійно створено  рекомбінантні плазміди, оптимізовано умови детекції наявності гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах ссавців, оптимізовано  методи імунохімічно детекції АРОА1 людини in vitro та in vivo. Виділення та очищення плазмідної ДНК, виділення тотальної хромосомальної ДНК з клітин ссавців, ПЛР та мунохімічне дослідження експресії гена АРОА1 людини виконан безпосередньо здобувачем. Роботи із культивування культури клітин СНО-К1, одержання транзиторно експресуючих та стабільно трансфікованих клітин СНО-К1, проводились спільно з м.н.с. Т. А. Рубан та н.с. О. М. Сухорадою. Розрахунок схем конструювання рекомбінантних плазмід та розрахунок праймерів було проведено спільно із м.н.с. Д. М. Іродовим. Роботи, пов’язані із піддослідними тваринами проводили у співробітництві з Інститутом геронтології АМН України. Розробка програми вирішення поставлених завдань, аналіз і обговорення одержаних результатів досліджень проведені спільно з м.н.с. Д. М. Іродовим,  д.мед.н. С. Н. Новіковою, м.н.с. О. К. Топоровою, а також завідувачем відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, д.б.н., професором, чл.-кор. НАН України, академіком АМН України В. А. Кордюмом, з якими автор має спільні публікації.

Автор висловлю подяку науковому керівнику д.б.н., професору, чл.-кор. НАН України, академіку АМН України В. А. Кордюму за корисні поради та критичні зауваження, а також всім співробітникам, які сприяли її виконанню.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах та з’їздах: XXX Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Аахен, Німеччина, 2003), Конференції, присвяченій 50-річчю відкриття подвійної спіралі ДНК (Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, Україна, 2003), Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004), XXXI Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Варшава, Польща, 2004), Конференції молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2006» (Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, Київ, Україна, 2006), ХІV Щорічному міжнародному конгрес вропейського товариства генної терапії (Афіни, Греція, 2006), а також на наукових семінарах відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертац опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та тези 6 доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, які  представлені у 5-ти розділах, аналізу та узагальнення результатів, списку використаних джерел (328 найменувань). Роботу викладено на 150 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 35 рисунками і 4 таблицями.

Страницы: 1, 2, 3, 4


© 2010.